A estimativa da medição em microbiologia de alimentos

As bactérias são os micro-organismos mais importantes para o processador de alimentos, muitos são inofensivos, muitos são altamente benéficos, alguns indicam a provável presença de sujeira, organismos patológicos, deterioração e alguns causam doenças. Existem milhares de espécies de bactérias, mas todas são unicelulares e se dividem em três formas básicas: esféricas, hastes retas e hastes em espiral. Com um microscópio que amplie cerca de 1.000 vezes, pode-se observar esses seres que se reproduzem dividindo-se em duas células que se se dividem para se tornar 4, 4 se tornam 8 e assim por diante. Sob condições ideais, essa duplicação pode ocorrer tão frequentemente quanto a cada 15 minutos, para que, dentro de 5 horas, haja mais de um milhão de células da única original. Se houver 1.000 células originais em vez de uma única, haverá mais de 1 bilhão de células em 5 horas. Conheça como realizar a estimativa e a expressão da incerteza de medição (IM) associada a resultados quantitativos em microbiologia de alimentos.

alimento2Da Redação –

Pode ser destacado que algumas bactérias em forma de bastonete são capazes de existir em duas formas: esporos adormecidos e células vegetativas ativas. As células vegetativas formam esporos em condições adversas como meio de sobrevivência. As formas de esporos preservam as bactérias da fome, secagem, congelamento, produtos químicos e calor.

Quando as condições se tornam favoráveis, os esporos germinam, com cada esporo novamente se tornando uma célula vegetativa com capacidade de se reproduzir. Entre as bactérias, a esporulação não é um meio de reprodução, pois cada célula forma um único esporo que mais tarde germina em uma única célula. A maioria das bactérias esporulantes que crescem na presença de ar pertencem ao gênero Bacillus e a maioria que cresce apenas na ausência de ar pertence ao gênero Clostridium.

Já as leveduras são ovais e ligeiramente maiores que as bactérias. Elas se reproduzem mais frequentemente brotando e, ao brotar, cada célula pode produzir vários brotos que se rompem para formar novas células filhas totalmente formadas. Amostras encontradas em pão, frutas, papel úmido ou outras superfícies são realmente compostas por milhões de células microscópicas unidas para formar cadeias.

As cadeias geralmente têm numerosos ramos chamados hifas e as amostras prosperam em condições muito adversas para bactérias ou leveduras. Elas se reproduzem por esporos que frequentemente estão presentes como massas verdes ou pretas nas hifas salientes. Assim, as leveduras e bolores crescem na maioria dos alimentos, equipamentos e superfícies de edifícios, onde há pequenas quantidades de nutrientes e umidade.

Como as bactérias crescem mais rapidamente, elas superam em muito os fermentos e os fungos na maioria dos alimentos. No entanto, as bactérias acham condições de baixo pH, umidade ou temperatura e alto teor de sal ou açúcar favoráveis e, por consequência, nesses ambientes, as leveduras ou os fungos predominam. Podem se tornar um problema em alimentos secos, peixe salgado, pão, picles, frutas, compotas, geleias e produtos similares.

Pode-se acrescentar que os vírus são os micro-organismos menores e mais simples. Ao contrário das bactérias, leveduras e fungos, os vírus são incapazes de se reproduzir independentemente. Em vez disso, eles devem primeiro invadir as células de outro organismo vivo chamado hospedeiro, antes que possam se multiplicar.

Portanto, eles são parasitários. Os vírus são normalmente específicos na seleção de células hospedeiras, algumas infectando apenas uma espécie, enquanto outras são capazes de infectar espécies intimamente relacionadas.

Como resultado, os vírus que infectam bactérias, chamados bacteriófagos, não podem infectar seres humanos ou outros animais. Por outro lado, vários vírus animais, conhecidos como zoonotis, podem infectar seres humanos. Os vírus são importantes para o processo alimentar em dois aspectos: como bacteriófago de bactérias lácticas ou outras bactérias fermentativas. As infecções bacteriófago das culturas iniciadoras podem interferir seriamente na fabricação de queijo, soro de leite coalhado, chucrute, picles, vinho, cerveja e outros produtos fermentativos desejáveis.

Eles podem transmitir doença pelos alimentos aos seres humanos. Embora os vírus exijam uma célula hospedeira viva e não possam se multiplicar nos alimentos, eles podem permanecer viáveis e infecciosos por longos períodos de tempo, mesmo sob condições altamente adversas, como secagem, congelamento e pasteurização.

Dessa forma, o processador de alimentos pode reduzir possíveis problemas de microrganismos de várias maneiras. Removê-los ou destruí-los aparando, lavando, aquecendo, decapando, adicionando produtos químicos ou incentivando a concorrência de organismos formadores de ácido ou álcool. Também, podem minimizar o crescimento microbiano nos equipamentos, limpando e higienizando, e no próprio produto, ajustando a temperatura de armazenamento, o pH e outros fatores ambientais.

Embora cada fator que afeta o crescimento seja considerado separadamente, esses problemas podem ocorrer simultaneamente na natureza. Quando mais de uma condição é um tanto adversa ao crescimento microbiano, seus efeitos inibitórios são cumulativos. A temperatura é o meio mais eficiente para controlar o crescimento microbiano.

Com base em sua tolerância a amplas faixas de temperatura, os microrganismos são classificados da seguinte maneira: psicrofias crescem apenas em temperaturas de refrigeração; os psicrotróficos crescem bem em temperaturas de refrigeração, mas melhor em temperatura ambiente; os mesófilos crescem melhor na temperatura do corpo humano ou perto dele, mas crescem bem à temperatura ambiente; e os termófilos crescem apenas em temperaturas quase tão quentes quanto a mão humana pode suportar e geralmente nem na temperatura corporal ou abaixo dela.

Ser mais específico sobre esses limites de temperatura do crescimento é entrar na controvérsia que continua desde o início da microbiologia, pois existem muitas espécies que crescem em faixas de temperatura que se sobrepõem a elas. Assim, pode-se dizer que a microbiologia alimentar é o estudo dos micro-organismos que habitam, criam ou contaminam os alimentos, incluindo o estudo de microrganismos que causam deterioração dos alimentos.

As bactérias denominadas boas, no entanto, como os probióticos, estão se tornando cada vez mais importantes na ciência de alimentos. Os micro-organismos estão envolvidos na deterioração dos alimentos, intoxicação alimentar e também na preservação e na produção de alimentos.

Algumas das principais fontes de micro-organismos presentes nos alimentos incluem plantas, animais que atacam o trato intestinal e a pele, ar, esgoto, solo, equipamentos, moscas, etc. Tanto os fatores intrínsecos quanto os extrínsecos dos alimentos afetam o crescimento microbiano. Os fatores intrínsecos geralmente incluem pH, conteúdo de umidade, potencial de redução da oxidação, conteúdo de nutrientes, constituintes antimicrobianos e estruturas biológicas.

Os fatores extrínsecos geralmente incluem temperatura de armazenamento, umidade relativa do ambiente, concentração de gases e atividade de outros microrganismos. Alguns dos indicadores mais comuns de segurança alimentar são a Escherichia coli, Enterococcus spp e o E Staphylococcus aureus.

A preservação de alimentos pode ser feita em vários métodos, como produtos químicos, ambiente modificado, radiações, altas temperaturas, alta pressão hidrostática e secagem. Os produtos químicos como ácido benzoico, ácido sórbico, nitritos e nitratos, NaCl são alguns dos mais usados. A embalagem a vácuo é usada principalmente em atmosferas modificadas. A radiação ultravioleta e os raios gama também são utilizados para a proteção dos alimentos contra a deterioração.

Em resumo, deve haver procedimentos de controle de qualidade, procedimentos para validação e determinação da incerteza de medição como um importante elemento de garantia de qualidade no laboratório de microbiologia de alimentos para análises qualitativas e quantitativas. A acreditação deve ser realizada de acordo com a NBR ISO/IEC 17025 de 12/2017 – Requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração que especifica os requisitos gerais para a competência, imparcialidade e operação consistente de laboratórios.

Os requisitos gerais para a competência dos laboratórios de ensaio e calibração, que garantem a conformidade com os procedimentos operacionais padrão e a competência técnica da equipe envolvida nos ensaios, necessitam ser introduzidos amplamente nos laboratórios de microbiologia de alimentos. Além disso, deve ser feita a introdução de um manual de qualidade e muitos documentos gerais, alguns dos procedimentos mais exigentes nos laboratórios de rotina de microbiologia são procedimentos de medição de incerteza e estabelecimento de experimentos de validação.

Importante salientar que, como os micro-organismos são facilmente dispersos, exibem diversidade fisiológica e toleram condições extremas, eles são onipresentes e podem contaminar e crescer em muitos produtos alimentares. O comportamento das populações microbianas nos alimentos (crescimento, sobrevivência ou morte) é determinado pelas propriedades dos alimentos (por exemplo, atividade da água e pH) e pelas condições de armazenamento (por exemplo, temperatura, umidade relativa e atmosfera).

O efeito dessas propriedades pode ser previsto por modelos matemáticos derivados de estudos quantitativos em populações microbianas. A temperatura é um fator importante que contribui para doenças transmitidas por alimentos e deve-se monitorar o histórico de temperatura durante o processamento, distribuição e armazenamento de alimentos que é um meio simples e eficaz de reduzir a incidência de intoxicação alimentar. A interpretação dos perfis de temperatura por programas de computador baseados em modelos preditivos permite decisões informadas sobre o prazo de validade e a segurança dos alimentos.

A ABNT ISO/TS 19036 de 09/2014 – Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal – Diretrizes para a estimativa da incerteza de medição para determinações quantitativas fornece as orientações para a estimativa e expressão da incerteza de medição (IM) associada a resultados quantitativos em microbiologia de alimentos. É aplicável à análise quantitativa de: produtos destinados ao consumo humano e à alimentação de animais, e amostras ambientais em área de produção de alimentos e de manipulação de alimentos, tipicamente efetuada por enumeração de microrganismos utilizando a técnica de contagem de colônias, mas aplicável também à análise quantitativa por métodos instrumentais alternativos.

Não é aplicável à enumeração usando a técnica de número mais provável. Nesta especificação técnica, a IM é estimada usando uma abordagem simplificada que considera a distribuição de Poisson e é, portanto, aplicável a qualquer resultado, incluindo baixas contagens e/ou números baixos de organismos. A definição de baixas contagens e/ou números baixos de micro-organismos vai variar de acordo com o microrganismo e a matriz que estão sendo analisados, bem como o método utilizado. A abordagem é global, com base no desvio-padrão da reprodutibilidade do resultado final da medição.

O Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM) é uma abordagem padrão amplamente adotada que recomenda, como ilustrado nos exemplos apresentados, a estimativa das fontes individuais de variabilidade que contribuem para a incerteza no processo de medição. A incerteza global é então obtida usando princípios formais de propagação de incerteza. Esta abordagem tem sido descrita de um modo mais prático para medições analíticas, principalmente de natureza química, pelo EURACHEM/CITAC Guide e também para microbiologia na Referência.

O ISO/TC 34/SC 9 considera que esta abordagem passo a passo não se aplica de forma satisfatória no caso de análises microbiológicas de alimentos, nas quais é difícil construir um modelo realmente abrangente do processo de medição. Por causa da grande possibilidade de não se considerar alguma fonte significativa de incerteza, existe um elevado risco de se subestimar o verdadeiro valor da IM. Além disso, parece difícil quantificar com precisão a contribuição de cada passo individual do processo analítico em microbiologia de alimentos, onde o analisado é um organismo vivo, cujo estado fisiológico pode ser amplamente variável, e o alvo analítico inclui cepas de espécies ou gêneros diferentes.

Em outras palavras, as análises microbiológicas não permitem uma rigorosa estimativa metrologicamente e estatisticamente válida de IM. O ISO/TC 34/SC 9, por conseguinte, escolheu uma abordagem top down ou global de IM, a qual se baseia em um desvio-padrão de reprodutibilidade do resultado final do processo de medição. Esta é uma abordagem com base em resultados experimentais (com a repetição da mesma análise), que, no caso de microbiologia, parece mais significativa do que a abordagem passo a passo.

A abordagem global foi aprovada para um uso mais geral pelo ISO/TS 21748 elaborado pelo ISO/TC 69, Application of statistical methods, SC 6, Measurement methods and results. Este documento esclarece que a abordagem passo a passo e a abordagem global não são mutuamente exclusivas, uma vez que todos os componentes IM podem ser considerados para inclusão no desempenho global do processo de análise, que pode ser caracterizado pela precisão observável e pelo viés.

É adotada uma abordagem global para a estimativa da IM. É baseada na variabilidade global do processo analítico, tendo como efeito o resultado do ensaio. Esta variabilidade global inclui a precisão observável (componente aleatório) e o viés(componente sistemático). Na prática, na área de microbiologia de alimentos, somente a precisão é considerada. A abordagem global da estimativa IM é derivada de uma estimativa experimental do desvio-padrão da reprodutibilidade do resultado final do processo de medição completo. Este desvio-padrão corresponde à incerteza-padrão combinada.

A abordagem global pode ser considerada uma caixa preta do sistema, como ilustrado na figura abaixo, em que as principais fontes de incertezas em microbiologia de alimentos são identificadas. Este diagrama pode ser útil na identificação das fontes de incerteza que são cobertas ou não pelo protocolo experimental escolhido.

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Na figura acima, a amostragem [desenho da unidade de amostragem (s) a ser ensaiada a partir do lote a ser controlado] introduz uma parte (se não a mais importante) significativa do erro total, mas que não faz parte da incerteza associada à medição si. Subamostragem significa o desenho da alíquota de ensaio a partir de uma amostra analítica (uma das unidades extraídas do lote). Esta alíquota de ensaio é usada para a preparação da suspensão inicial em técnicas de contagem de bactérias, de acordo com a NBR ISO 6887-1:2011.

As principais fontes de incerteza durante o processo de análise são o analista/tempo e os equipamentos/cultura/reagentes. Por fim, os erros residuais aleatórios são os não explicados pelos fatores anteriores, e, geralmente, avaliados dentro de um laboratório sob condições de repetibilidade. Enquanto isso, a adoção desta abordagem global exige que os resultados venham de um procedimento de medição que se demonstra estar sob controle.

É geralmente considerado que o viés não é levado em conta na estimativa IM, dada devido à natureza empírica das contagens microbianas. Em outras palavras, o procedimento analítico determina diretamente o resultado da medição, por exemplo, o número de unidades formadoras de colônias por unidade de amostra. Assim, não é possível, na prática, determinar um valor real, o que é necessário para se determinar o viés.

Mesmo quando se utilizam materiais de referência certificados, ou valores derivados de ensaios interlaboratoriais, apenas uma parte do viés total pode ser avaliada. Ao mesmo tempo, reconhece-se que parte do viés pode ser estimada por meio de estudos interlaboratoriais que são utilizados em duas das opções estabelecidas nesta especificação técnica para avaliar o desvio-padrão da reprodutibilidade (ver Seções 6 e 7). O método que leva em consideração a incerteza do componente viés não está descrito.

No entanto, mesmo que o componente viés da IM não possa ser formalmente avaliado, pode-se demonstrar que o viés associado ao laboratório está sob controle, através da participação, por exemplo, em ensaios de proficiência interlaboratorial ou de ensaios que utilizam materiais de referência (certificados). Quando os componentes principais de incerteza estão sob controle, a incerteza-padrão combinada uC(y) (2.3) é, em geral, a combinação de uma incerteza-padrão relacionada à precisão observável e, se for caso, com o viés.

A incerteza-padrão combinada é estimada pelo desvio-padrão experimental da reprodutibilidade no resultado final da medição, combinada com um componente estimado pela distribuição de Poisson. O método de combinação de uma incerteza-padrão relacionada com o viés não está descrito. Três possibilidades diferentes foram escolhidas para a estimativa do desvio-padrão da reprodutibilidade (sR), com ordem de prioridade, como descrito abaixo: opção 1: desvio-padrão intralaboratorial de reprodutibilidade; opção 2: desvio-padrão da reprodutibilidade do método derivado de um estudo interlaboratorial; opção 3: desvio-padrão da reprodutibilidade derivado de um ensaio de proficiência interlaboratorial.

Uma forte prioridade é dada para a primeira opção, a qual foi ensaiada e para a qual um protocolo experimental é descrito em detalhes. Regras gerais para a estimativa do desvio-padrão de reprodutibilidade são dadas em 4.4, e cada opção é detalhada nas Seções 5 a 7. Convém que o conceito de caixa preta descrito seja levado em consideração o maior número possível de fontes de incerteza considerados na figura acima.

Em particular, convém que o laboratório tenha conhecimento da distribuição de microrganismos nas matrizes sob ensaio, de modo a levar isto em consideração quando da estimativa do componente de subamostragem da incerteza. O desvio-padrão da reprodutibilidade deve ser estimado para cada tipo de microrganismo-alvo (ou grupo consistente de microrganismos-alvo) e para cada matriz (ou grupo consistente de matrizes), para um dado método que o laboratório rotineiramente utiliza para obter seus resultados.

O termo consistente significa que o grupo de micro-organismos/métodos ou matrizes gera valores equivalentes de IM. A estimativa de IM está associada ao laboratório e liga um determinado IM ao resultado relevante do ensaio, determinado em condições definidas, como analistas, procedimento de operação, equipamentos, reagentes etc. A estimativa de IM não caracteriza o método analítico por si só, independentemente do laboratório que a implementa.

De acordo com os princípios da NBR ISO/IEC 17025, convém que os fatores críticos associados com o método ou o laboratório que são suscetíveis de afetar o resultado da medição sejam identificados e seja demonstrado que estão sob controle. Exemplos de tais fatores críticos são a origem e o tipo do meio de cultura e/ou outros reagentes (como os usados para a confirmação), as técnicas de contagem (manual ou automatizada), o analista ou grupo de analistas, etc.

O monitoramento contínuo da estimativa de IM é necessário para demonstrar que essa estimativa permanece relevante e que os resultados dos ensaios estão sob controle. Uma reavaliação da estimativa de IM é necessária quando forem alterados quaisquer dos fatores críticos. O desvio-padrão da reprodutibilidade intralaboratorial é a opção preferida para se estimar a IM, pois permite que o laboratório fixe o valor de IM para os resultados obtidos, respeitando assim o princípio da definição de IM.

Isto corresponde a um caso particular de precisão intermediária, como apresentado na ISO 5725-3. Uma desvantagem teórica desta opção é que não é possível levar em conta o viés. Em microbiologia de alimento, o efeito da matriz sobre a IM não é possível de ser evitado, deste modo o protocolo experimental leva em consideração o efeito da subamostragem para a obtenção da alíquota de ensaio, a partir da amostra de laboratório (por exemplo, a amostra de alimento ensaiada).



Categorias:Metrologia, Normalização, Qualidade

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